細(xì)胞培養(yǎng)的具體操作步驟以及注意事項(xiàng)
細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境（無(wú)菌、適宜溫度、酸堿度和一定營(yíng)養(yǎng)條件等），使之生存、生長(zhǎng)、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)*的過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)研究方法中重要和常用技術(shù)，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)既可以獲得大量細(xì)胞，又可以借此研究細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的合成代謝、細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等。
一、細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。
加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤(pán)中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、細(xì)胞傳代
細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。
加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經(jīng)高壓滅菌，保存于40C），吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×106/盤(pán)接種，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞凍存
細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，去培養(yǎng)基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異bing醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi)，過(guò)夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個(gè)月。
凍存液的配制：70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
注意事項(xiàng)
?。?）進(jìn)入細(xì)胞間開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：
?、俅_定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題，不確定的溶液和耗材請(qǐng)勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。
?、诖_定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。
?、鄞_定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話(huà)及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充。
?、艽_定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開(kāi)啟瓶蓋，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前可以把所有瓶蓋旋松。
?、荼M量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒(méi)有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請(qǐng)用噴過(guò)75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周?chē)ú灰佑|到瓶口）后在火焰上簡(jiǎn)單燒灼。
?、薏僮鲿r(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時(shí)更換。
⑦實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面。
（2）細(xì)胞污染的預(yù)防
?、賹?shí)驗(yàn)用品防止污染。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*，各種溶液滅菌要仔細(xì)，并在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。
?、诓僮鬟^(guò)程防止污染。
?、鄞┲菀灼痨o電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間。
?、軐?shí)驗(yàn)開(kāi)始前需要確定戴的手套沒(méi)有問(wèn)題，只要接觸過(guò)生物安全柜之外的物品，必須及時(shí)對(duì)手套進(jìn)行消毒。
?、葸M(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門(mén)，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開(kāi)始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材、溶液和細(xì)胞，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大規(guī)模污染。
⑥細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口，并將瓶口放在火焰周?chē)?jiǎn)單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。
?、邔?shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低，盡量減少談話(huà)，打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對(duì)不能對(duì)著工作區(qū)，以免造成不必要的污染。
⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。
⑨不要從敞開(kāi)的容器口上方經(jīng)過(guò)，以避免衣服上掉落不明物體對(duì)細(xì)胞的污染。
?、鈱?shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無(wú)法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面。
?。?）防止細(xì)胞交叉污染
?、僭谶M(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，作上標(biāo)記便于辨別。按順序進(jìn)行操作，一次只處理一種細(xì)胞，多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂。
?、谠谶M(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞。
③所有細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或自己建立，必須及時(shí)保種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。
